pTO-T快速克隆试剂盒
产品说明

    产品概述:

           pTO-T快速克隆试剂盒利用拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。适用于克隆由Taq DNA聚合酶扩增的3'端带有“A”末端的产物。载体元件包含高拷贝的复制子,Amp抗性基因,可以用引物对M13F(-47)和M13R(-48)进行菌落PCR鉴定阳性克隆。

    产品组成:

    组成

    CL05020

    CL05060

    2×pTO-T Mix

    (每5ul Mix30ng载体pTO-T

    100ul

    100ul×3

    Control Insert

    5ul

    5ul

    M13F引物(10uM)

    50ul

    150ul

    M13R引物(10uM)

    50ul

    150ul

    产品特点:

  • 连接反应仅需5分钟
  • 体系配置简单,只需加入片段和pTO-T Mix
  • 适用于Taq DNA聚合酶扩增的3'端带有“A”末端的产物
  • 具有氨苄青霉素
  • 无需蓝白斑筛选,阳性率大于90%
  • 质量控制检测 :

           使用本试剂盒连接Control Insert(1kb),涂布于A抗性平板上,用菌落PCR或质粒酶切方法验证次日长出的克隆,阳性克隆达到总克隆数90%及以上。

    贮存

           -20℃保存12个月,避免反复冻融

    使用说明

    1、连接反应

        按下表,在一个0.2ml PCR管内依次加入

       

    2、反应温度及片段要求

           室温下(20℃-30℃)放置5~10分钟,然后将离心管放置在冰上。当天如不进行转化实验,请将连接产物置于-20℃保存。注意DNA片段的用量见下表:

        

           如果PCR产物电泳检测仅有单一条带,无引物二聚体和非特异性条带存在,可直接取产物原液进行克隆。

    3、阳性对照反应

           取5ul试剂盒提供的1kb长度的对照片段进行克隆。

    4、 转化


  • 取10ul连接产物到100ul刚刚融化的DH5a或TOP10感受态细胞中(不建议使用TOP10F`感受态细胞),轻轻混匀,冰浴10-30分钟。
  • 42℃水浴中热击90秒。
  • 立刻置于冰水浴中2分钟。
  • 加入500ul无菌的不含抗生素的SOC或LB液体培养基,37℃,200-250rpm振荡培养60分钟。
  • 吸取200ul菌液涂布。为了得到更多的菌落,可以先4000rpm离心1分钟,去掉部分上清,用移液器轻吹菌体,充分悬浮菌液,取全部菌液涂布,然后37℃培养过夜(12-16小时)

  • 5、 阳性重组子的鉴定

           菌落PCR
           用10ul枪头挑选克隆至预先加有10ul无菌水或LB培养基的PCR管中,吹打混匀。取2ul细菌悬液为模板,50ul PCR体系中加入10uM浓度的M13F/M13R各1ul进行PCR扩增。
           1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。电泳条带大小与插入片段大小相近(由于M13引物在克隆位置的两侧,所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大156bp)的克隆可视为阳性克隆。菌落PCR鉴定重组体时一定要设立一个不加菌液的阴性对照,以排除PCR扩增的条带为假阳性的可能。
           测序:用M13F和M13R对阳性克隆的质粒进行测序分析。

    常见问题分析:

    转化次日平板克隆少,或阳性率低?


  • 感受态效率低,使用转化效率>5×107 cfu/ug的感受态细胞。
  • 连接反应在低温下操作,应当在室温下操作。
  • 连接反应时间过长,室温下5分钟就可以,时间过长,连接效率会下降。
  • PCR片段加入量太多或太少,按照推荐量加入。
  • PCR纯度低,切胶时在紫外灯下照射时间长,需重新制备。
  • PCR扩增结束后,应该再延伸5-10分钟,确保片段延伸完全。
  • 转化后没有复苏培养,可以加入SOC或LB液体培养基,培养60分钟。
  • 克隆基因可能对宿主菌有毒性,比如某些编码膜蛋白和DNA结合蛋白的基因,某些启动子和调节序列基因,或含有倒置或串联重复序列的基因,选用25-30℃室温过夜培养,或者选择转化能够有效针对毒性基因的EPI400感受态细胞。

  • pTO-T载体图谱和多克隆位点序列

产品内容
    产品名称 产品编号 规 格 单位 价格(RMB)
    pTO-T CL05020 20次 500元
    pTO-T CL05060 60次 1380元
           
    说明书
订购信息
下载产品订购表或产品订购合同并按要求填写后发送至sales@generalbiol.com,公司收到订单或产品订购合同会及时与您回复及确认,并安排相关人员生产发运。
  • 订单或合同下载 为保证您的订单或订购合同顺利上传,请您下载最新订单或订购合同。
  • 邮箱:sales@generalbiol.com
  • 电话: 0550-3721555
  • 传真:0550-3721086
在线客服